Terapia Génica

Bases conceptuales de la terapia génica por Fátima Bosch

En los últimos años se ha producido un gran avance en la utilización de genes con fines terapéuticos. Se podría decir que la terapia génica “nació” de golpe en 1990 cuando se llevó a cabo en los National Institutes of Health de los USA (por M. Blease y F. Anderson) el primer protocolo de terapia génica en niños con inmunodeficiencia por déficit de adenosina deaminasa, que permitió una gran mejoría en estos pacientes. La gran difusión en los diferentes medios de comunicación de todo el mundo de este primer protocolo hizo que un campo que todavía estaba iniciándose crease unas expectativas tan grandes, que ha llevado a que muchos con el tiempo se hayan sentido defraudados porque se esperaban resultados positivos muy rápidos. Sin embargo, si bien la terapia génica “saltó a la fama” demasiado pronto, muy probablemente debido a que las sociedades avanzadas pensaron encontrar el remedio para aquellas enfermedades que las terapias con fármacos convencionales no podían solucionar, el campo de la terapia génica ha avanzado mucho en esta última década. Además, se han ido desarrollando toda una serie de herramientas para la transferencia génica que están resultando también extremadamente útiles para muchas otras áreas de la investigación biológica (obtención de animales transgénicos, ingeniería metabólica, señalización intracelular, etc.).

La terapia génica se trata de una terapia somática. Es decir, se pretende curar con genes únicamente a un individuo y no a su descendencia. Si bien podría ser de interés en el caso de enfermedades hereditarias, la terapia génica germinal es actualmente impensable por dos razones: seguridad y ética. Hoy por hoy, no disponemos de herramientas adecuadas y precisas para la transferencia génica. Además, no está permitido llevar a cabo ningún protocolo en humanos en el que de alguna manera se puedan afectar las líneas germinales. No obstante, el dilema más importante es ético: ¿abrirá esta tecnología la puerta hacia el ”diseño de bebés”?. Los científicos deben tomar conciencia de que la potencial aplicación de la terapia génica germinal carece todavía de procedimientos fiables y seguros. Si en el futuro se dispusiese ellos, sería necesario un gran debate ético en la sociedad y una legislación que limitase sus usos.

En cuanto a la terapia génica somática, en la actualidad se llevan a cabo dos tipos de aproximaciones terapéuticas: una, denominada terapia génica in vivo, en la cual el gen de interés se introduce en un vector y a continuación este vector se transfiere directamente al paciente. La otra aproximación, denominada terapia génica ex vivo, se basa en que el gen se interés se introduce en un vector y este vector se transfiere a células en cultivo (que pueden ser del propio paciente o bien pueden ser incluso líneas celulares establecidas). Posteriormente, estas células manipuladas genéticamente se transplantan al paciente. Esta terapia ex vivo, está comportando el desarrollo de toda una nueva industria a su alrededor centrada en el empaquetamiento de células modificadas genéticamente productoras de fármacos (normalmente proteínas de secreción, como podría ser la insulina en el caso de la diabetes, o bien un factor de crecimiento en enfermedades neurodegenerativas).

Dado el amplio campo de acción de la terapia génica, debemos tener en cuenta dos aspectos claves: por un lado qué “gen curativo” es el más adecuado y por otro qué vector vamos a utilizar para transferirlo al tejido diana. También debe tenerse en cuenta la vía de administración del vector. Todo ello dependerá de la enfermedad se pretenda abordar en el protocolo de terapia génica.

En cuanto al gen, si se trata de una enfermedad hereditaria monogénica el gen a transferir es fácilmente identificable, ya que se tratará de introducir una copia correcta del gen mutado. Así por ejemplo, se están investigando diferentes aproximaciones para gran número de enfermedades como la hemofilia B, distrofias musculares, fibrosis quística, mucopolisacaridosis, inmunodeficiencias, etc., y algunos de estos estudios han permitido poner en marcha varios protocolos en humanos. Así, en el Hospital Necker, en París, el grupo del Dr. Alan Fischer consiguió curar una inmunosuficiencia combinada severa muy grave. Sin embargo, recientemente, este protocolo ha presentado efectos adversos muy serios. Por otro lado, para la hemofilia B, los resultados de los protocolos clínicos parecen muy esperanzadores. Todos estos avances permitirán que en un futuro más o menos lejano la terapia génica será una realidad para muchas enfermedades que hasta ahora son incurables.

Sin embargo, en la mayoría de las aproximaciones que se están estudiando actualmente no se pretende contrarrestar el gen causal de una determinada enfermedad sino las consecuencias de dicha alteración génica. Ello es debido a que en muchas ocasiones se desconoce cual es el gen iniciador que se altera y da lugar a un determinado proceso patológico. Este sería el caso del cáncer, de la diabetes, del sida, de enfermedades cardiovasculares, etc. Así, tanto para enfermedades hereditarias poligénicas como para las no hereditarias, las estrategias de terapia génica son más complejas. Los genes a transferir dependerán de los estudios previos sobre el conocimiento más profundo de la patogenia y, a partir de ello, de la “imaginación” de los científicos en diseñar estrategias que permitan revertir la sintomatología. Aquí radica uno de los problemas de la falta de éxito o bien del retraso en la obtención de protocolos funcionantes: en muchos casos el investigador no conoce suficientemente el origen de la enfermedad, ni los genes implicados en la patogenia, ni que promotores son los más adecuados para regular la expresión de los posibles genes terapéuticos una vez transferidos in vivo. Así, en el caso del cáncer se están llevando a cabo aproximaciones muy distintas: transferir genes suicidas en el caso de tumores sólidos, que transforman un profármaco no tóxico en un compuesto letal para la célula, o bien utilizar genes que estimulan la respuesta inmune antitumoral, o factores antiangiogénicos, o transferir secuencias antisentido que bloquean la expresión de oncogenes o incluso genes supresores de tumores, etc.

En cuanto a los vectores utilizados en la terapia génica, se está investigando muy activamente con el fin de desarrollar nuevos vectores más efectivos y con menos efectos adversos. Existen dos grandes grupos: los vectores virales y los vectores no virales. No se puede afirmar cuál es el vector ideal, ya que su uso dependerá en cada caso de la patología que se quiera tratar, si es una enfermedad crónica o no, a qué tejido/s se debe acceder, cuánto tiempo debe durar la expresión del gen curativo, si se trata de una aproximación in vivo o ex vivo, etc. Mayoritariamente los protocolos que están aprobados para su aplicación clínica utilizan vectores virales, ya que in vivo, los vectores no virales no han conseguido niveles muy elevados de transferencia génica.

Respecto a los vectores virales, en un principio los más empleados fueron los vectores retrovirales (derivados de retrovirus murinos), y hasta hace poco la mayoría de los protocolos que se estaban aplicando en humanos se han llevado a cabo utilizando retrovirus. Estos vectores están siendo desplazados por los virus adenoasociados (AAV), por los lentivirus (LV) y por los adenovirus (Ad). Estos últimos vectores son capaces de infectar células que no se dividen. Los Ad permiten expresar niveles elevados de genes exógenos in vivo. Sin embargo, la expresión es transitoria, ya que estos vectores no se integran en el genoma y además son muy inmunogénicos. Las últimas generaciones de estos vectores que se utilizan son los denominados “gut-less” (en los que se han delecionado los genes virales, dejando únicamente los elementos que definen el inicio y el final del genoma y las secuencias de empaquetamiento del virus). Con ellos se ha conseguido mantener la expresión durante varios meses y, además, se ha disminuido su inmunogenicidad. Los AAV permiten expresar genes exógenos durante largos periodos de tiempo (más de seis meses). Actualmente, se han descrito gran número de trabajos en que se han utilizado estos vectores para transferir genes a músculo esquelético, hígado, pulmones, etc., de ratas y ratones. Además, también se han utilizado para transferir el gen del factor IX de la coagulación a perros hemofílicos y en pacientes humanos. Por último, los LV son retrovirus derivados del virus HIV humano, que se integran también en el genoma y que pueden ser muy útiles para expresar genes a largo plazo en cerebro. Los LV y los AAV son más útiles para enfermedades de tipo crónico, mientras que los Ad pueden ser de elección en algunos tipos de cáncer.

Los vectores no virales (liposomas, polimeros catiónicos, etc), si bien se están utilizando ampliamente para estudios in vitro, su aplicación in vivo no ha dado muy buenos resultados. No obstante, recientemente se ha descrito que la electrotransferencia de DNA desnudo a músculo parece una técnica muy prometedora. El DNA plasmídico inyectado directamente en solución a músculo esquelético es captado por las miofibras, y los genes que se encuentran en el vector plasmídico se pueden expresar incluso durante los dos meses siguientes. La naturaleza postmitótica y la longevidad de las miofibras permiten la expresión estable de los genes transferidos, si bien el DNA exógeno no se integra en los cromosomas. De entre las técnicas de transferencia de genes no virales, este método es simple, barato y seguro. Este sistema es muy útil para la liberación sistémica de proteínas de interés. Sin embargo, los niveles de expresión de proteínas exógenas que se consiguen en la mayoría de los casos no son muy elevados. Ello podría ser en parte debido a la cantidad de DNA que pueden captar las miofibras. Recientemente se ha descrito que la aplicación de una descarga eléctrica (de unos 200 V/cm) en el músculo en el momento de la inyección del DNA incrementa 100 veces los niveles de producción de proteínas de interés, debido al incremento en la captación de DNA por las miofibras. Además, muy recientemente se ha descrito que si previo a la electrotransferencia se inyecta a músculo esquelético hialuronidasa se produce un gran incremento en la eficiencia de transferencia. En nuestro laboratorio hemos podido comprobar que con esta metodología alrededor del 75% de la masa muscular expresa el gen transferido.

Para conseguir terapias más efectivas, hay una gran necesidad de investigar en la mejora de los vectores actuales, tanto virales como no virales. Se necesitan vectores que tengan una especificidad mucho más grande para el tejido diana, se debe evitar en muchos casos la respuesta inmune y reducir la toxicidad, tanto del gen “curativo” como del vector. El tamaño del gen a transferir también es un punto importante, ya que la capacidad de empaquetar genes en un virus es relativamente pequeña. Así, en un AAV no se puede introducir más de 4 Kb de DNA. Si pensamos en el caso de la fibrosis quística, el gen completo es tan grande que no lo podemos poner entero en un Ad y se suele utilizar el cDNA correspondiente. Por otra parte, se debe conseguir que los genes se expresen en las células diana de manera regulada. En el caso de los vectores virales y de los no virales, también se debe tener en cuenta que tienen que ser estables durante el proceso de purificación, almacenamiento y administración. Así, tenemos que ser capaces de producir virus que se puedan enviar de una ciudad o un país a otro. Además, otro aspecto que se está intentado resolver es la producción eficaz a gran escala de vectores virales para la aplicación en protocolos clínicos.

Otro punto clave también en el campo de la terapia génica es disponer de modelos animales en los cuales probar las nuevas terapias antes de aplicarlas a humanos. Se deberían desarrollar animales manipulados genéticamente que desarrollasen patologías similares a las de los humanos, sobre todo para terapias génicas de enfermedades hereditarias y, así, se evitaría el ensayo de estas terapias directamente en pacientes. Actualmente, gracias a toda la tecnología de obtención de animales transgénicos y knock-out, una vez clonado el gen responsable de una determinada patología, podemos desarrollar el modelo animal que lo sobreexprese o que sea deficiente, emulando la enfermedad humana.

En un principio la terapia génica nació para pacientes con enfermedades monogénicas hereditarias, para los cuales no existe otra solución. No obstante, la mayor parte de los protocolos que se están aplicando a humanos son para enfermedades poligénicas y no hereditarias, principalmente cáncer o sida. Ello es debido a los elevados costos que representa desarrollar un protocolo hasta su aplicación en humanos y, por tanto, la terapia génica necesita de financiación por parte de las empresas. Debido al elevado número de pacientes y a su potencial interés económico se están realizando grandes esfuerzos para el desarrollo de terapias contra el cáncer. Actualmente, también se están potenciando aproximaciones para enfermedades cardiovasculares. Dada la necesidad de la implicación de empresas en el desarrollo de un protocolo de terapia génica, la investigación está condicionada en sus aspectos más básicos, ya que obliga a patentar todos los “pasos” del proceso (desde los genes quiméricos, vectores, sistemas de transferencia, etc.). Todo esto ha hecho cambiar en muchos casos la mentalidad de los científicos y de los centros de investigación preocupados ahora más en los rendimientos y en la transferencia rápida de la tecnología que en una investigación más básica y rigurosa, llevando en algunos casos a fracasos importantes.

Cuando se ha demostrado experimentalmente que una nueva aproximación tiene una eficacia terapéutica, el paso siguiente es demostrar que es segura. Una vez se ha demostrado que es segura en animales de laboratorio (ratones, ratas), podemos empezar a diseñar un protocolo para aplicar en humanos. No obstante, antes de aplicarlo en humanos, se deben realizar pruebas en animales más grandes, como perros, cerdos, monos, etc. En los protocolos que actualmente están aprobados para su aplicación en humanos (publicados en la revista Human Gene Therapy) se presenta una descripción muy detallada de todos los estudios preclínicos y de los diversos modelos animales en los que se ha ensayado, junto con todos los estudios de bioseguridad. Por tanto, unido al protocolo de terapia génica hay una fase preclínica, que puede ser muy larga y muy amplia, que involucra investigación básica y que va desde la clonación de los genes al diseño de nuevos vectores, estudios en células, transferencia en animales, análisis de nuevos promotores, etc. hasta llegar a ensayos clínicos en modelos animales.

Con el fin de desarrollar más eficientemente el campo de la terapia génica, los investigadores que en él trabajamos hemos creado varias sociedades científicas. En 1992, la primera sociedad que se puso en marcha fue el Grupo de Trabajo Europeo de Transferencia y Terapia Genética en Humanos (European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy, EWGT). El grupo ha sido muy productivo y ha influido en la UE para que invierta recursos en el campo de la terapia génica. En 1998, se le pasó a denominar Sociedad Europea de Terapia Génica. También en este año se creó la Sociedad Americana de Terapia Génica. En nuestro país, en 1998 se puso en marcha la Red de Terapia Génica de Cataluña y en el 2000 se creó la Sociedad Española de Terapia Génica y recientemente ha pasado a denominarse Sociedad Española de Terapia Génica y Celular (setgyc).

Actualmente, ya se encuentran en fase clínica gran número protocolos en USA y en Europa, la mayoría de ellos para cáncer, seguido de enfermedades monogénicas y enfermedades infecciosas (según la Web de John Wiley & Sons http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/). En España, la investigación en terapia génica está aún en sus inicios y presenta un gran retraso respecto a nuestros vecinos europeos. Si bien se han puesto en marcha unos pocos protocolos para cáncer, la mayoría de los grupos están realizando estudios centrados en fases preclínicas aun bastante tempranas para vislumbrar una aplicación en humanos en un futuro próximo. El reducido número de grupos interesados en terapia génica muy probablemente se verá incrementado ya que las administraciones publicas y también fundaciones privadas han decidido convertir la terapia génica en un área prioritaria dentro de la Investigación Biomédica. Sin embargo, será necesario aún un mayor esfuerzo que lleve a la creación de centros de investigación especializados en este campo, que permitan asesorar en la producción y utilización de los diferentes vectores a los investigadores interesados en llevar a cabo proyectos. Ello conjuntamente con una mayor formación de los médicos en estas áreas permitirá que nuestro país pueda avanzar en el campo de la terapia génica de manera similar a los demás países de la UE. Con esta finalidad, la Universidad Autónoma de Barcelona, dentro del Proyecto de Biocampus, ha creado el Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG), un centro de investigación altamente especializado en desarrollar, producir y utilizar técnicas de transferencia génica en Biomedicina. CBATEG ofrecerá a la comunidad científica sus servicios para la obtención y análisis de modelos animales y para el diseño, producción y control de calidad de vectores virales y no virales.